INTRODUÇÃO: O teste de supressão com 1 mg de dexametasona (TSDx) é amplamente empregado no rastreamento da síndrome de Cushing (SC) dada sua elevada acurácia diagnóstica. A SC é um distúrbio endocrinometabólico resultante do hipercortisolismo crônico com característica de ausência de supressão do cortisol no TSDx. OBJETIVO: Desenvolver um radioimunoensaio (RIE) para a dosagem de dexametasona (Dx) no soro para complementar o TSDx. MÉTODOS: Foram imunizados três coelhos com o conjugado dexametasona-21-hemissuccinato-BSA para escolha do melhor anticorpo e o RIE foi desenvolvido de acordo com as recomendações da RE 899/2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Analisamos 96 voluntários, sendo 67 submetidos ao TSDx e 29 não, e 12 pacientes com SC, estudados na Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) e na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. RESULTADOS: O anticorpo contra Dx selecionado mostrou boa especificidade, coeficiente de variação (CV%) intra e interensaio < 20%, exatidão de 93,8% e dose mínima detectada de 19,5 ng/dl. A concentração de Dx no soro foi semelhante nos voluntários e pacientes com SC (ausência/supressão do cortisol): 205 a 703 ng/dl e 174 a 661 ng/dl (intervalo de confiança [IC] 95%), respectivamente; os valores foram indetectáveis naqueles que não se submeteram ao teste. DISCUSSÃO: O anticorpo empregado apresenta boa afinidade e especificidade para quantificar a Dx no soro. O RIE mostrou reprodutibilidade e eficiência na determinação dos níveis séricos de Dx durante o TSDx. CONCLUSÃO: O presente RIE para a dosagem de Dx no soro é acurado e confiável, permitindo estabelecer uma faixa de referência de valores para subsidiar a interpretação do TSDx.

INTRODUCTION: The 1 mg dexamethasone suppression test (DxST) is widely used to screen Cushing's syndrome (CS) due to its high diagnostic accuracy. CS is an endocrine-metabolic disorder caused by hypercorticism, which is characterized by the absence of cortisol suppression in DxST. OBJECTIVE: To develop a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of serum dexamethasone (Dx) to complement DxST. METHODS: Three rabbits were inoculated with dexamethasone-21-hemisuccinate-BSA in order to choose the best antibody. Serum Dx RIA was performed according to RE 899/2003 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária [ANVISA]) regulations. Serum samples from 96 volunteers from Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) and Santa Casa de Misericórdia de São Paulo were analyzed, 67 of which were submitted to DxST and 29 were not. There were 12 patients with CS. RESULTS: The Dx antibody chosen showed good specificity. Intra- and interassay CV were < 20% with 93.8% accuracy and the lowest detection limit was 19.5 ng/dl. Serum Dx concentration was similar among both volunteers and CS patients (absence of cortisol suppression): 205 to 703 ng/dl and 174 to 661 ng/dl (95% CI), respectively. Values were undetectable among those that were not submitted to the test. Discussion: The anti-Dx antibody shows high specificity and reliability to quantify serum Dx in DxST. The Dx RIA presented reproducibility and reliability in the determination of serum Dx levels during DxST. CONCLUSION: The current RIA for serum Dx is accurate and reliable, which permits to establish a reference value range to substantiate DxST interpretation.

A dosagem de testosterona sérica, total ou fração livre, é metodologia de alto valor diagnóstico e encontra-se disponível na maioria dos laboratórios clínicos. Esta disponibilidade foi possível pelo desenvolvimento de metodologias simples e diretas, adaptáveis a plataformas de dosagem automatizada. Uma série de publicações recentes tem alertado quanto às limitações destas metodologias, em especial em amostras com baixas concentrações, como mulheres e crianças. Neste trabalho serão apresentados os resultados do emprego de uma metodologia de referência, fundamentada em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS), e sua comparação com uma dosagem de rotina (ensaio eletroquimioluminescente - ECLIA). Os métodos são comparados tanto na dosagem de testosterona total (n = 213) quanto na determinação de testosterona livre calculada com base na determinação da testosterona total e da proteína carregadora de hormônios sexuais (SHBG) (n = 135). Os valores obtidos com o ECLIA são significativamente mais elevados, sendo a dispersão mais nítida em soros com baixas concentrações. Tal fenômeno fica mais claro quando apresentado na forma de gráficos de Bland-Altman. Neste trabalho são discutidas as dificuldades de implementação de uma metodologia de referência, como a apresentada, e a convivência com as metodologias de rotina, bem como a literatura recente sobre o assunto.

Serum testosterone in its total or free form, is a highly valuable diagnostic test and is available in the great majority of clinical laboratories. This reality was possible due to the development of simple and direct assays, adaptable to large automatic systems. Recent publications have called attention to the limitations of these simplified methodologies, mainly in samples with low concentration, as women and children. In this paper we present results obtained using a reference method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS) and its comparison with those obtained with a commercial routine immunoassay (electrochemiluminescent assay, ECLIA). Methods were compared in total testosterone measurement (n = 213), as well as in free testosterone evaluation based on calculation inclu-ding sex hormone-binding protein (SHBG) levels (n = 135). Values obtained with ECLIA were significantly higher, with more marked dispersion in low concentration. This phenomenon is clearer when presented as a Bland-Altman plot. Difficulties in the implementation of reference methods as the one presented are discussed, as well as the necessity of caution in the interpretation of values obtained with routine assays, a matter of several publications in recent literature.

A dosagem de cortisol livre na urina (CLU) é um método útil na triagem de pacientes suspeitos de síndrome de Cushing. Os imunoensaios atuais apresentam limitações que dificultam sua aplicação e a comparação de resultados por diferentes ensaios. No presente método para dosagem de cortisol e cortisona livres urinários, baseado em cromatografia líquida com detecção por espectrômetro de massa em tandem (LC-MS/MS), uma alíquota de urina 24h (200µL) é misturada com solução contendo quantidade conhecida de cortisol deuterado e extraída on-line em fase sólida (C18). O eluato é transferido para uma segunda coluna C18 (Phenomenex Luna, 3µ, de 50 x 2mm), e o eluato obtido em modo isocrático é aplicado diretamente no MS/MS modelo Quattro Micro, operando no modo positivo de ionização química a pressão atmosférica (APCI). Todo o processo é automatizado e a quantificação é feita por diluição isotópica com base nas razões das áreas dos picos dos analitos e do padrão interno deuterado. O estudo de especificidade mostrou que nenhum esteróide testado apresenta reatividade cruzada superior a 1% com cortisol ou cortisona. A sensibilidade funcional é <1µg/L para os dois esteróides, e o CV interensaio <8%. Os estudos de recuperação e de linearidade foram satisfatórios, e a comparação entre os resultados obtidos para cortisol em 98 amostras de rotina, pelo ensaio em estudo e por um RIE, mostraram correlação de r= 0,838, sendo os valores obtidos por LC-MS/MS significativamente mais baixos (medianas de 22,0 e 49,4µg/24h, respectivamente) (P<0,0001). Os valores de referência para cortisol foram definidos entre 11 e 43µg/24h, compatíveis com métodos semelhantes recentemente descritos. A dosagem concomitante de cortisona livre urinária permite o estudo da atividade da enzima 11beta-HSD2 e a pesquisa da síndrome do excesso aparente de mineralocorticóides. O método descrito representa a primeira descrição, em nosso meio, de uma nova geração de métodos para a medida de esteróides hormonais, baseados em processos preparativos automatizados e leitura por espectrometria de massa em tandem.

Free urinary cortisol (UFF) measurement is one of the most useful screening tests for Cushing's syndrome. Immunoassays employed today by most clinical laboratories present limitations, specially concerning specificity. These limitations restrain a widespread application of the method, as well as the comparison of results obtained by the use of different methods. We present the development and characterization of a UFF and cortisone method based on liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A 200µL aliquot from a 24h urine sample is mixed with a solution containing a known quantity of deuterated cortisol and on-line extracted in solid phase (C18). The eluate is transferred to a second C18 column (Phenomenex Luna, 3µ, 50x2 mm) and the isocratic mode elution profile is directly applied to a tandem mass spectrometer model Quattro Micro operating in positive mode atmospheric pressure chemical ionization (APCI). All process is automated and the quantification is performed by isotopic dilution, based on the analyte and the deuterated internal standard peak area ratios. The specificity study showed that all the steroids tested presented cross reactivity of <1% for cortisol and cortisone. Functional sensitivity is <1µg/L for both steroids, and the interassay CV <8%. Recovery and linearity studies were satisfactory and comparison of results obtained using a RIA for UFF and the present method in 98 routine samples showed a correlation of r= 0.838, with the results obtained with LC-MS/MS significantly lower (medians of 22.0 vs. 49.4µg/24h for RIA) (P<0.0001). Reference values for cortisol were defined as values between 11 and 43µg/24h, compatible to those recently described for similar methods. The concomitant measurement of UF cortisone allows the study of the activity of the enzyme 11beta-HSD2 and the diagnosis of the apparent mineralocorticoid excess syndrome. The method represents the first steroid assay of a new generation, based on automated preparative methods and tandem mass spectrometry, described in our country.

A dosagem dos esteróides hormonais tem apresentado evolução técnica significativa, sendo os principais esteróides de interesse clínico dosados, atualmente, por métodos simples, rápidos e automatizados. Existe, no entanto, um compromisso em detrimento da exatidão, que é mais evidente na determinação de esteróides de menor concentração relativa e maior número de interferentes potenciais, como a 17-hidroxiprogesterona (17OHP), a diidrotestosterona (DHT) e outros. Nestes casos, um processo preparativo versátil e robusto é fundamental para garantir resultados com alto grau de exatidão. Apresentamos a padronização de um processo preparativo baseado em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) comparado à cromatografia em coluna de celite para a dosagem de 17OHP e DHT. Os anticorpos empregados nos respectivos radioimunoensaios apresentam especificidade semelhante aos descritos na literatura. As amostras foram inicialmente extraídas em éter etílico e em seguida submetidas ao processo cromatográfico. Amostras de soro provenientes da rotina foram dosadas em paralelo pelos dois métodos, sendo 57 amostras para 17OHP e 84 para DHT. Não houve diferença significativa entre os resultados, e os índices de correlação foram elevados (R= 0,95 e 0,97). Os resultados comprovam que a aplicação do HPLC é válida, além de ser mais reprodutível, versátil e menos operador-dependente. Sua aplicação mais ampla permitirá uma melhora de exatidão na dosagem de esteróides de baixa concentração relativa, onde os métodos mais simples resultam em valores falsamente elevados.

Measurement of steroid hormones has undergone a significant technical evolution so that steroids with greater clinical interest are, nowadays, measured with methods that are simple, fast and prone to automation. Nevertheless, a compromise is made in detriment of accuracy, which is more evident with steroids with lower concentration and more potential interferents, as 17-hydroxyprogesterone (17OHP), dihydrotestosterone (DHT), and others. In such cases, a robust and versatile preparative process is of utmost importance to warrant results with the highest degree of accuracy. In this paper we present the results obtained with the use of a preparative process based on high-pressure chromatography (HPLC) for the measurement of 17OHP and DHT, as compared with a process based on celite column chromatography. The antibodies used in the radioimmunoassays have similar specificity to those previously described for these kinds of assays. Samples were initially extracted in ethyl ether and then submitted to HPLC. Routine samples (57 for 17OHP and 84 for DHT) were measured in parallel with both methods. The differences between results were not statistically significant, and the correlation indexes were high (R= 0.95 and 0.97). Our results confirm that systems based on HPLC are valid, besides being more robust, versatile and operator independent. A more pervasive application of HPLC preparation systems will allow an improvement in the accuracy of steroid measurements, specially those with low concentrations, where simple preparative processes result in falsely elevated results.